記憶障礙動物模型

引起動物的記憶障礙有多種方法，包括電休克、缺血缺氧、某些化學藥品等。對記憶障礙的測定則采用學習記憶的實驗方法。在此先介紹常用的學習記憶實驗法。

1 學習、記憶實驗法(learn and memory test)

人們和動物的精神活動、心理狀態(tài)都是無法直接觀察到的。為了研究這些活動的發(fā)生過程，科學家們只能根據(jù)可觀察到的刺激反應進行推測。對腦內(nèi)記憶過程的研究只能從人類或動物學習或執(zhí)行某項任務后間隔時間，測量他們的操作成績或反應時間，由此來衡量這些過程的編碼形式、儲存量、保持時間以及它們所依賴的條件等。學習、記憶實驗方法的基礎是條件反射，各種各樣的方法均由此衍生而來。現(xiàn)簡介常用的動物學習、記憶實驗方法。

1.1 跳臺法(step down test)

(1)實驗方法  大鼠和小鼠跳臺法均較常用。

實驗裝置為1只長方形實驗箱，箱內(nèi)用黑色塑料板分隔成獨立的5個小間，每個小間的規(guī)格為12cm×12cm×20cm(小鼠)或23cm×25cm×40cm(大鼠)。反射箱底部是間距為1cm的銅柵，可以通電，電壓強度可由一變壓器調(diào)控，一般采用40V電壓。每間內(nèi)有一可自由移動的、高和直徑均為4.5cm的平臺(小鼠)或高為5cm、直徑為8cm(大鼠)，一般置于左后或右后角。

將動物放入反射箱內(nèi)適應環(huán)境3min，然后予以通電。動物受到電擊后，其正常反應是尋找躲避傷害性刺激的可能，因此很快會跳上平臺。多數(shù)動物可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺，如此訓練5min，記錄儀將記錄每鼠受到電擊的次數(shù)或叫錯誤次數(shù)，以此作為學習成績。24h后重作測試：將小鼠放在平臺上，然后予以通電，動物自平臺跳至銅柵上的時間為次跳下平臺的潛伏期，此即記憶保持測驗。記錄受電擊的動物數(shù)、每鼠次跳下平臺的潛伏期和3min內(nèi)的錯誤總次數(shù)。

(2)模型特點和比較醫(yī)學  該模型屬回避性條件反射實驗，本法簡便易行，一次可同時測試5只動物。既可觀察藥物對記憶過程的影響，也可觀察對學習的影響，敏感性較高，適合對藥物的初篩。缺點是動物的回避性反應差異較大，可采取對動物進行預選的方法以減少差異性。跳臺法在電擊前如果施以條件刺激，則可同時觀察被動和主動回避性反應。

1.2 避暗法(step through test)

(1)實驗方法  此法是利用鼠類的嗜暗習性而設計的，常用動物為小鼠。

實驗裝置包括明、暗兩室。小鼠明室大小為11cm×3.2cm，其上方約20cm處有1盞白熾燈照明，暗室大小為17cm×3.2cm。兩室之間隔板底部有1個直徑為3cm的圓洞。兩室底部均為銅柵，暗室內(nèi)的銅柵可以通電。電壓強度可由一變壓器調(diào)控，一般采用40V電壓。暗室與一計時、計數(shù)器相連，可自動記錄動物由明室進入暗室的潛伏期和進入暗室的次數(shù)。

實驗時將小鼠背朝洞口放入明室，同時啟動計時、計數(shù)器。動物穿過洞口進入暗室即受到電擊，此即小鼠次由明室進入暗室遇到電擊所需的時間(潛伏期)，取出小鼠。24h后再次測試，記錄動物進入暗室的潛伏期、5min內(nèi)的電擊次數(shù)和受電擊的動物數(shù)。

(2)模型特點  該模型也屬于回避性條件反射實驗，實驗方法簡便易行，以潛伏期作為指標，其準確度高于跳臺法，對記憶過程特別是記憶再現(xiàn)有較高的敏感性。大量研究資料顯示，小鼠的平均潛伏期約十幾秒，訓練期接受一次電擊后，記憶的保持可持續(xù)l周之久。

1.3 迷津(maze)

迷津的種類和裝置繁多，但不外乎由3個基本部分組成：起步區(qū)、跑道或稱路徑、目標區(qū)(放置食物或安全區(qū))。動物由起步區(qū)開始訓練，經(jīng)過復雜的路徑尋找過程，終到達目標區(qū)。正常動物經(jīng)過訓練，可很快到達目標區(qū)。而記憶障礙動物，此過程明顯長于正常對照的動物。迷津包括Y型迷路、水迷路和Morris迷津。

1.Y型迷路(Y-maze)

(1)實驗裝置  該裝置一般分成三等份，分別稱之為Ⅰ臂(中間臂，為起步區(qū))、Ⅱ臂(右側(cè)臂，為電擊區(qū)，與電刺激器相連)、Ⅲ臂(左側(cè)，為安全區(qū))。

(2)實驗動物  健康小鼠，體重為20～22g。

(3)實驗方法  在此介紹兩種訓練方法。

種：將動物放入起步區(qū)，操縱電擊控制器訓練小鼠遭遇電擊時直接逃避至左側(cè)安全區(qū)為正確反應，反之為錯誤反應。訓練方法有以下三種：①固定訓練10～15次，記錄正確和錯誤反應的次數(shù)。②動物在連續(xù)獲得二次正確反應前所需的電擊次數(shù)。③動物的學習成績達到9/10次正確反應前所需的電擊次數(shù)。24h后測驗動物的記憶成績。此法簡單、屬一次性訓練的空間辨別反應試驗。

第二種：按上述方法訓練完成后，將Ⅱ臂改為起步區(qū)，動物在遭遇電擊后直接逃至T臂(左側(cè))為正確反應，逃至Ⅲ臂(右側(cè))則為錯誤反應。訓練達到要求后，再將Ⅲ臂改為起步區(qū)，動物于電擊后逃至左側(cè)(Ⅱ臂)為正確反應，逃至右側(cè)(Ⅰ臂)為錯誤反應。以動物在三臂訓練均達到規(guī)定標準所需電擊次數(shù)的總和作為學習成績。24h或48h后測定動物的記憶成績。

(4)注意事項  ①如果在目標區(qū)放置食物，則動物于實驗前需禁食，以使其體重減至原體重的85％，這樣動物才具有攝食的驅(qū)動力。②在目標區(qū)停留的時間不能太短暫，否則失去強化效果。③每天訓練結(jié)束后需清洗實驗箱，以消除動物留下的氣味。④每天訓練次數(shù)以10～15次為宜。

2.水迷路(water maze)

水迷路的種類很多，在此介紹一種較復雜的水迷路。如圖13-1所示：S為起步區(qū)，F(xiàn)為目標區(qū)。在目標區(qū)有一爬梯，動物可爬出水面而獲得休息。此爬梯可移至圖13-1B中的“1”和“2”的位置，分別是指訓練第1日和第2日爬梯放置的位置，即為第1日訓練動物游至1處，第2日訓練動物游至2處。現(xiàn)已有中國醫(yī)學科學院藥物研究所制造的“水迷宮程序自動控制儀”供選用。

3.莫里斯水迷津(Morris water maze test)

20世紀80年代初，英國心理學家Morris等利用大鼠在盛有水和牛奶混懸的不透明的水池中搜尋目標物的方法，研究大鼠的海馬等腦區(qū)受到損害后的學習、記憶能力的變化，取得了令人矚目的結(jié)果。這種裝置可觀察并記錄動物入水后搜尋目標所需時間、采用的策略和它們的運動軌跡，有助于分析和推斷動物的學習、記憶、空間定向以及認知功能等方面的能力。現(xiàn)已較廣泛采用，稱之為莫里斯水迷津法。

(1)實驗裝置  該實驗裝置由黑色塑料圓桶、攝像頭、視頻采集卡、視頻分析軟件和計算機等構(gòu)成。用于大鼠實驗：圓桶直徑為160cm、高為45cm、水池的水深為40cm；用于小鼠實驗：圓桶直徑為120cm、高為40cm、水池的水深為30cm。水池內(nèi)有一站臺，站臺直徑對小鼠實驗為6cm、對大鼠實驗為9cm。在圓桶的上緣等距離地設東、南、西和北4個標記點，作為動物進水池的入水點。以這4個入水點在水面和圓桶底部的投影點，將水面和圓桶部分分成均等的4個象限。按實驗要求，可地將站臺放置于某一象限的中間(圖13-2)。

(2)實驗方法  實驗前將圓桶灌以清水至預定的水池高度，再加入適量的黑色顏料(白色鼠)或奶粉(黑色鼠)，使水池成為不透明狀。水溫控制在23～25℃之間。將站臺放置在水池的預定部位，作為動物入水后搜索的目標。站臺的頂端平面應低于水面2cm，這樣動物憑視覺無法辨認水池中有無站臺。實驗程序如下：

1)訓練方法  每只動物每天訓練4次。每天將動物按東、南、西和北4個入水點分別放入水池。實驗時，將動物頭朝池壁輕輕地放入水中。同時開啟視頻采集系統(tǒng)，此系統(tǒng)將采集動物自入水到找到站臺后四肢爬上站臺時所需要的時間，即潛伏期。同時記錄動物入水后的游泳軌跡，并分析動物在水中活動的總時間、總路程、上臺前路程、潛伏期、分別在4個象限的活動時間和路程、分別在站臺周圍Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ區(qū)域內(nèi)的活動時間和路程等多項指標。

動物爬上站臺后，讓動物在站臺上站立10s。若動物入水后在60s內(nèi)未能找到水池中的站臺或未能爬上站臺，可將動物放置于站臺上站立10s。然后將動物從站臺上拿下來。休息30～60s以后，再進行下一次訓練。

一般情況下，正常動物或服用促智藥物的動物在經(jīng)過5～6個實驗日的訓練后很快就學會以丨快丨佳的軌跡搜索到站臺的位置。此階段的實驗稱之為定位航行實驗。

2)撤臺實驗  第6或第7個實驗日將站臺撤除，并將動物從池壁的一點面朝壁輕輕放入水中。正常動物會在站臺的原來位置不斷尋找，表現(xiàn)為穿過站臺原有位置的次數(shù)明顯增多以及在站臺周圍活動的時間明顯延長。而智力障礙的動物穿過站臺原有位置的次數(shù)明顯減少，或在水中呈現(xiàn)無目標的游泳。此階段的實驗稱之為空間探索試驗。

(3)模型特點  影響該實驗結(jié)果的因素很多，其中以實驗環(huán)境較為重要。實驗室的設備、儀器、工作臺、椅子、門窗和燈具等陳設的位置和實驗操作者所站立的位置在整個實驗過程中均需固定，否則會影響實驗結(jié)果。因為動物常常會利用實驗室內(nèi)固有的環(huán)境作為它搜索目標時的參照物。由于莫里斯水迷津的水容量大，所以動物的排泄物和所分泌的外激素不會影響其他動物的作業(yè)成績，這一特點優(yōu)于其他的動物行為試驗方法。

(4)比較醫(yī)學  莫里斯水迷津法操作簡便，方法可靠。藥物、神經(jīng)毒素、血管性癡呆以及多種因素引起的記憶障礙動物模型，均可使動物的潛伏期延長，撤臺實驗時穿越原有站臺位置的次數(shù)明顯減少，并可引起定向障礙和運動軌跡混亂。而有效的促智藥物可使?jié)摲诳s短，增強動物的定向能力，從而能提前達到學會的標準。因此，奠里斯水迷津法可用來檢驗神經(jīng)藥物對動物的學習、記憶和定向能力的影響，并可用來篩選促智藥物。

2 記憶障礙動物模型

回避性條件反射方法雖已得到廣泛應用，但動物經(jīng)一次訓練即可學會逃避電擊，且很快趨于鞏固，并可維持相當長一段時間。在這種情況下觀察藥物改善學習記憶的作用是困難的，即使受試物有很好的藥效，但由于組間差異甚小，因此也是無法通過統(tǒng)計學檢驗的。現(xiàn)研究者通常采用記憶缺失的動物模型，這不但有助于評定藥物的作用，還可以初步分析藥物的作用機制。

(1)實驗方法  完整的記憶過程包括記憶獲得、鞏固與再現(xiàn)三個階段。不同類型的記憶障礙模型可分別觀察藥物對上述三個階段的影響。形成記憶障礙的方法很多，主要有：電休克，腦部缺血、缺氧，某些化學藥品，應激，剝奪睡眠，老年動物以及有遺傳缺陷的動物等。下面分別介紹記憶獲得障礙、記憶鞏固障礙和記憶再現(xiàn)缺失動物模型的形成方法。

1)記憶獲得障礙  抗膽堿能藥物影響記憶的機制比較清楚，結(jié)果且易于重復，并且無明顯非特異性作用，用此類藥物來造成記憶獲得障礙模型是較為理想的，因此在國內(nèi)外得到廣泛采用。常用的抗膽堿藥物是東莨菪堿，其次為樟柳堿。于訓練前30min經(jīng)腹腔注射給藥一次，劑量為2～4mg/kg體重，可顯著破壞動物學習和記憶的獲得。利血平、戊丨巴丨比丨妥丨鈉、氯丙嚓、利丨眠丨寧等中樞抑制劑均可明顯抑制記憶的獲得。

2)記憶鞏固障礙  常用的方法有電休克，缺氧和給予蛋白質(zhì)合成抑制劑等。

①電休克：動物訓練結(jié)束后立即將電極接于其頭部和鼻部，給予一強度為7mA的電流刺激，持續(xù)1s，24h后重作測驗，動物的記憶將不再保持。

②缺氧：造成缺氧的方法有以下幾種：訓練后立即將小鼠置于密閉的罐子里，通以96.2％N2和3.8％O2的混合氣體，直至動物倒地意識喪失時為止；給動物吸入純CO2；皮下注射NaNO2(120mg/kg體重)。這些方法均可破壞記憶的鞏固。

③蛋白質(zhì)合成抑制劑；常用的藥物有環(huán)己酰亞胺、氯霉素、茴香霉素等。其中以環(huán)己酰亞胺的作用易于重復，結(jié)果可靠。用藥劑量為120mg/kg體重，于訓練后立即或訓練*min腹腔注射一次，即可破壞記憶的鞏固。

3)記憶再現(xiàn)缺失  經(jīng)訓練的小鼠于重測前30min經(jīng)腹腔注射40％～45％乙醇(0.1ml/10g體重)，可明顯干擾記憶的再現(xiàn)。乙醇價廉易得，結(jié)果穩(wěn)定，易于重復，對中樞和一般運動功能無明顯影響。但其影響記憶的機制還不清楚。

(2)給藥方案  采用不同的給藥方案和不同類型的記憶障礙模型，可分別觀察藥物對學習效應和記憶不同階段的影響，從而可更地了解受試藥物作用的性質(zhì)和特點。可采取訓練前、訓練后以及重測前給藥的方法。

訓練前給藥：于訓練前幾天給藥可觀察藥物對長期學習效應的影響；訓練前數(shù)分鐘內(nèi)給藥可觀察藥物對學習成績和記憶獲得的影響。

訓練后給藥：于訓練后立即或短時間內(nèi)給藥可觀察藥物對記憶鞏固作用的影響，訓練后幾天繼續(xù)給藥可觀察藥物對記憶保持的作用。

重測前給藥：經(jīng)過訓練，動物于重測前數(shù)分鐘內(nèi)給藥可觀察藥物對記憶再現(xiàn)的影響。

但上述給藥方案不是的。有些學習、記憶實驗，動物需經(jīng)過多次或多天訓練才能學會執(zhí)行某一操作(如莫里斯水迷津)。因此，藥物的效果很可能是對學習、記憶獲得和記憶保持的綜合作用結(jié)果。

(3)注意事項  學習、記憶試驗應在隔音室或半隔音室內(nèi)進行，實驗時要保持環(huán)境安靜，室內(nèi)溫度、濕度和光照度應適宜并保持一致；實驗前數(shù)天將動物移至實驗室以適應周圍環(huán)境；實驗者需每天接觸動物如喂水、喂食和撫摸動物，實驗應選擇適宜時間進行，每天的實驗要在同一時間內(nèi)完成。

(4)結(jié)果評價  一個藥物是否有效，至少要滿足以下幾個條件：①結(jié)果經(jīng)得起重復。②藥物有量一效關(guān)系或其作用規(guī)律。③在不同類型實驗方法和不同類型動物模型中均顯示效果，并且在作用性質(zhì)和方向上相吻合。

對于實驗結(jié)果需進行綜合分析。因為藥物往往具有多方面的作用，有的作用易化記憶過程，而有的作用則阻抑記憶過程；或在給藥后不同時間分別產(chǎn)生不同的作用，以致在某一時間內(nèi)出現(xiàn)記憶改善，而在隨后的某一時間內(nèi)記憶減弱；并且同一藥物在腦的不同部位可產(chǎn)生不同的作用。另外，某些藥物在動物種屬產(chǎn)生陽性結(jié)果，而在另一些動物種屬則無效，這些都是應該在分析實驗結(jié)果時需要綜合考慮到的因素。