非條件反射焦慮模型

一、 探究行為焦慮模型

1.大鼠高架十字迷宮實驗(elevated plus maze test in rats)

(1)復制方法  健康雄性大鼠，體重為200～250g。

十字迷宮裝置一般為木制結(jié)構(gòu)，并漆成黑色。包括2個50cm×50cm的相對開臂和2個50cm×10cm×40cm的相對閉臂。閉臂上部敞開，中央有一10cm×10cm的開闊部。2個開臂和2個閉臂呈十字交叉，迷宮離開地面的高度為50cm，故稱高架十字迷宮。

將大鼠置于中央開闊部，面向其中的一個閉臂。觀察者在1.0m以外記錄5min內(nèi)大鼠進入開臂和閉臂的次數(shù)以及在兩臂滯留的時間(以四肢全部入臂或出臂為準)。計算大鼠進入開臂的次數(shù)和時間分別占總次數(shù)(兩臂次數(shù)之和)和總時間(在兩臂滯留時間之和)的百分比，以此作為評價焦慮的指標。通常這2個指標呈高度相關(guān)。

為了減少無關(guān)刺激對實驗的影響，在實驗前5～7d每天撫摸動物，并于實驗前先將大鼠置于一敞箱中活動5min，然后再放入迷宮進行實驗。這樣可提高大鼠入臂的總次數(shù)，避免大鼠躲在閉臂，增加實驗的準確性。

(2)模型特點  此模型是利用動物對新異環(huán)境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成的矛盾沖突狀態(tài)，由 Montgomery的研究工作發(fā)展而來的。大鼠放入迷宮后會主動探究開臂，但又懼怕開臂中高懸敞開的環(huán)境。抗焦慮劑增加大鼠進入開臂次數(shù)的百分比和在開臂滯留時間的百分比，但不改變?nèi)吮劭偞螖?shù)和總時間；致焦慮劑則在不影響總次數(shù)和總時間的劑量下使這2項指標減少。

(3)比較醫(yī)學  此實驗操作簡便，評價抗焦慮作用的結(jié)果可靠，但比較費時。此方法也可用于小鼠，并可得到與大鼠一致的結(jié)果。

2.大鼠開場實驗(open field test in rats)

(1)實驗方法

1)Stefanski法

復制方法  實驗裝置為1只直徑80cm、高30cm的圓形敞箱，敞箱底部中央劃有直徑分別為35cm和50cm的內(nèi)、外兩個圓圈，內(nèi)圈所包含的區(qū)域為中央?yún)^(qū)。將大鼠置于中央?yún)^(qū)，觀察10min內(nèi)大鼠總的活動次數(shù)、進入開場中央的次數(shù)以及在開場中央?yún)^(qū)停留的時間。實驗在弱光照明、65dB白噪聲的條件下進行。

2)開場飲水實驗(open field drink test)

復制方法  實驗裝置為1只36cm×36cm×36cm的透明有機玻璃方箱，頂部敞開，箱的左、右、后三側(cè)面及底部均為黑色，前側(cè)面無色透明以便觀察。箱的中央倒置懸掛一水瓶，瓶嘴離地面10cm，箱的上方離地面60cm處安置一盞25W的白熾燈。實驗前3d大鼠限制飲水，每天僅于下午3：00～4：00給予飲水1h。同時需每天撫摸大鼠1min，以減少非特異性應(yīng)激對實驗的影響。實驗時將大鼠置于開場中央，觀察動物開始飲水的潛伏期、飲水時間、靠近水瓶的次數(shù)和站立數(shù)等指標，觀察持續(xù)時間為10min。在每只大鼠實驗后，需清潔實驗箱，以防止嗅覺暗示影響下一只實驗鼠。

(2)模型特點  動物進入敞箱后由于對新異環(huán)境具有恐懼心理，因此主要在敞箱內(nèi)的周邊區(qū)域活動。但動物的探究特性又促使其產(chǎn)生在中央?yún)^(qū)域活動(如運動、飲水或進食等)的動機，因而形成沖突狀態(tài)。與大鼠高架十字迷宮實驗結(jié)果類似，抗焦慮劑可解除這種沖突狀態(tài)，在不改變活動計數(shù)的劑量下明顯增加大鼠進入敞箱中央?yún)^(qū)域的次數(shù)以及在中央?yún)^(qū)域停留的時間(Stefanski法)，或增加大鼠在中央?yún)^(qū)域的飲水時間(open field drink test)，致焦慮劑則反之。

(3)比較醫(yī)學  開場實驗設(shè)備簡單、操作容易，因此在行為學研究中已普遍應(yīng)用，多用來評價動物的運動活性等綜合行為。而作為抗焦慮模型，其穩(wěn)定性和可靠性還需進一步驗證，因此實驗者丨好結(jié)合其他的焦慮模型綜合評價藥物的效應(yīng)。

3.明暗穿箱實驗(light-dark transition test)

(1)復制方法  明暗穿箱實驗可分別采用大鼠和小鼠進行實驗，其原理相似。

1)大鼠明暗穿箱實驗  明暗箱(45cm×27cm×27cm)分明箱和暗箱2個部分。暗箱占1/3，頂部加蓋；明箱占2/3，頂部敞開，亮光照明。兩箱之間的隔板底部有一個7.5cm×7.5cm的門洞供動物穿過。明暗箱與動物活動計數(shù)儀相連，可同時記錄動物的運動活性。動物給藥后時間將其置于明箱中央，背對洞口，記錄10min內(nèi)動物的穿箱次數(shù)以及分別在明箱和暗箱的滯留時間。

2)小鼠明暗穿箱實驗  此處介紹一種Shimada改良法。 Shimada明暗箱的結(jié)構(gòu)為：在1只40cm×40cm×12cm的有機玻璃箱中央安裝一個20cm×20cm×12cm的透明有機玻璃小敞箱，在小敞箱的2個對角分別連有一個10cm×10cm×12cm的暗箱，暗箱的兩側(cè)各連有一個L型的跑道，暗箱與L型的跑道有一個3.5cm×3.5cm的洞口相通。裝置上方裝有攝像系統(tǒng)并連接視屏分析系統(tǒng)，以觀察小鼠的穿箱次數(shù)、在明箱滯留時間及運動活性。實驗時使小鼠背對暗箱的洞口，記錄10min內(nèi)小鼠的穿箱次數(shù)及分別在明暗箱的滯留時間。

(2)模型特點  此實驗是根據(jù)大鼠或小鼠喜歡在暗箱活動，但動物的探究習性又促使其試圖探究明箱而設(shè)計的。然而，明箱的光亮刺激又抑制動物在明箱的探究活動。抗焦慮作用可增加動物在明箱的站立、滯留時間和運動活性，增加穿箱次數(shù)，同時動物在暗箱的上述指標相應(yīng)減少，穿箱次數(shù)也減少。

(3)比較醫(yī)學  有抗焦慮作用的藥物均可增加動物的穿箱次數(shù)及在明箱的滯留時間、站立和運動活性，非抗焦慮劑則無此作用。在此模型上抗焦慮劑的相對作用強度與臨床試驗結(jié)果一致。此方法具有簡便易行、對動物施加的是無痛性刺激的優(yōu)點。缺點為所需時間漫長，早上和下午動物的活動性差異較大，建議實驗放在下午進行。

4.小鼠爬梯實驗(staircase test in mice)

(1)復制方法  選用雄性小鼠，體重為18～22g。

實驗裝置為一有機玻璃箱：長45cm、寬10cm、一端高12.5cm、另一端高25cm，箱內(nèi)有5級高2.5cm、寬10cm的相同樓梯。實驗時將小鼠置于箱的底部，使其背朝樓梯，記錄3min內(nèi)小鼠的站立數(shù)和爬梯數(shù)(以四肢都爬上樓梯為準)。實驗需在安靜、光線恒定的環(huán)境下進行。

(2)模型特點  此種方法篩選抗焦慮藥簡便易行，結(jié)果可靠，且由于小鼠的成本較低，因此實用于大規(guī)模篩選。為了簡化觀察，不需考慮動物下樓梯的級數(shù)。每只動物實驗結(jié)束后需清潔實驗箱，以排除嗅覺暗示對下一只動物的干擾。    (3)比較醫(yī)學  爬梯實驗用于探討動物探索性行為或活動性，動物的爬梯作為評價動物探究行為或活動性的指標，而直立則作為動物焦慮狀態(tài)的參數(shù)。抗焦慮劑在不減少爬梯數(shù)的劑量使站立數(shù)減少，從而使這2個指標分離。此外，能產(chǎn)生與藥物性焦慮變化無關(guān)的運動失調(diào)的藥物也可減少站立數(shù)，但同時也減少爬梯數(shù)。氟哌啶醇、抗抑郁藥以及其他能引起運動失調(diào)的藥物即可減少站立數(shù)，又可減少爬梯數(shù)。致焦慮劑并不產(chǎn)生與抗焦慮劑相反的結(jié)果，故評價致焦慮藥物時宜慎重。

5.小鼠四板實驗(four plat test in mice)

(1)復制方法  選用雄性小鼠，體重為18～22g。

實驗裝置為1只25cm×18cm×16cm的長方形箱，箱的底部有4塊8cm×11cm的相同金屬板，各板間均有一4mm寬的間隙，4塊板均與電刺激器相連，處于對角線的2塊板同極，使小鼠每當跨越上下或左右金屬板時受到一次電擊，電流強度為0.20～0.8mA。給藥后時間將小鼠置于板上，讓其探究15s后打開電刺激器。當小鼠受到電刺激時產(chǎn)生明顯的逃避反應(yīng)，通常穿過2塊到3塊板便會停下，計為1次。記錄10min內(nèi)每分鐘的電擊數(shù)。

(2)模型特點  四板法以被動回避為基礎(chǔ)，小鼠渴望探究，但又因害怕足電擊而使探究活動受到抑制。抗焦慮劑可緩解或解除這種抑制狀態(tài)，使小鼠受電擊次數(shù)增多，神經(jīng)松弛劑等非抗焦慮藥則無此作用。

(3)比較醫(yī)學  該方法操作簡便，不需訓練動物，因此廣泛用于抗焦慮藥物的篩選。然而，有些興丨奮丨劑(如苯丨丙丨胺)也可增加懲罰性跨板數(shù)(電擊數(shù))，有些抗焦慮劑反而無效。因此需結(jié)合其他焦慮模型的試驗結(jié)果綜合評價。

二、 大鼠群居接觸模型(Model of social interaction test in rats)

(1)復制方法  選用雄性大鼠，體重為200～250g。

實驗裝置為1只60cm×60cm×35cm的木箱，箱內(nèi)壁漆成黑色。箱的上部懸掛一盞白熾燈，實驗者可根據(jù)需要調(diào)節(jié)燈的功率大小或懸掛高度。大鼠于實驗前單養(yǎng)5～7d。實驗時按體重相近原則兩兩配對，配對大鼠的體重一般相差不超過15g，配對的2只大鼠藥物處理相同。實驗在4種條件下，分兩階段進行。這4種條件分別是：強光(300lx)照射、弱光(30lx)照射、動物對實驗箱熟悉、動物對實驗箱不熟悉。由此可組合為4種不同的實驗環(huán)境，即強光不熟悉、強光熟悉、弱光不熟悉、弱光熟悉。階段實驗是在大鼠不熟悉實驗箱的條件下，分別測定10min內(nèi)配對大鼠在強光和弱光環(huán)境下的主動接觸時間。主動接觸包括嗅、追、推、踢、騎跨、理毛、爬或鉆、扭打、格斗等，而被動的依靠則不計入在內(nèi)。若在箱的側(cè)壁上裝有紅外光電管，還町同時觀察動物的活動數(shù)和站立數(shù)。接著將大鼠單個放在箱內(nèi)，使之在自然光的條件下每天熟悉實驗箱10min，連續(xù)2d。接下來進行第二階段強光和弱光熟悉實驗，觀察時間和指標與階段相同。

(2)模型特點  此模型是基于大鼠在一個陌生的環(huán)境沒有建立自己的領(lǐng)地，表現(xiàn)出渴望接觸的動機而設(shè)計的。采用新異環(huán)境和強光條件作為致焦慮刺激，從而建立起大鼠群居相互接觸焦慮模型。未經(jīng)藥物處理的大鼠，其主動接觸時間在弱光熟悉多于強光不熟悉，而強光熟悉與弱光不熟悉則介于兩者之間。

為了排除群居接觸變化由一般刺激或鎮(zhèn)靜效應(yīng)引起的可能性，應(yīng)同時測定動物的運動活性(如開場實驗)。此模型選用小鼠很難達到預期的效果，因此該方法不適宜選用小鼠。

(3)比較醫(yī)學  由于該模型不需要訓練動物，也沒有剝奪飲食或外加電擊等惡性刺激，且穩(wěn)定可靠，因此是目前焦慮研究中使用多的模型之一。但不同類型的抗焦慮劑在此模型上的表現(xiàn)不相同。如：BDZ類藥物增加強光或不熟悉環(huán)境下大鼠的主動接觸時間，而在弱光熟悉條件下的作用極小；巴比妥類藥物則在4種條件下都使主動接觸增多。這兩類藥物的這種作用差別意義還不清楚。致焦慮劑則減少大鼠的主動接觸時間。此模型的不足之處尚有：①由于使用配對動物，一個動物的行為都嚴格依賴于其配對同伴的行為，因此很難檢測單個動物在行為上的差異。②動物消耗多。

三、  Vogel沖突實驗(Vogel conflict test)

(1)復制方法  選用雄性大鼠，體重為200～250g。

實驗裝置為Model-102型焦慮儀(美國Lafayette儀器公司)，由自動計數(shù)器、電刺激器和有機玻璃操作箱三部分組成。操作箱尺寸為45cm×24cm×21cm，其底部為不銹鋼柵條，條間距離為1cm。頂部蓋為一網(wǎng)眼狀不銹鋼蓋，頂蓋的一端插入一個水瓶，瓶嘴為不銹鋼材質(zhì)。瓶嘴深入箱內(nèi)6cm，距離底部柵條10cm，并與底部柵條一起通過導線與刺激器相連。瓶嘴外套*緣膠皮，以防大鼠觸及瓶嘴但未舔水時遭受電擊。

實驗分兩階段進行。階段為非懲罰飲水訓練：大鼠禁水24h后被單獨置于操作箱，讓其充分探究，直到發(fā)現(xiàn)瓶嘴并開始舔水。計數(shù)器自動記錄大鼠在3min內(nèi)的舔水次數(shù)，對舔水少于300次的大鼠予以淘汰。第二階段為懲罰實驗：未被淘汰的大鼠繼續(xù)禁水24h后再次被單獨置于操作箱。經(jīng)過階段的訓練，大鼠能很快找到瓶嘴并開始舔水。舔夠20次儀器自動開始計時并給予一次電擊(舔水與電擊次數(shù)之比為20：1)，電擊強度一般為0.2～0.5mA，持續(xù)2S，但大鼠可通過脫離瓶嘴來控制受電擊時間的長短。記錄懲罰期(也是3min)大鼠的舔水次數(shù)。

(2)模型特點與比較醫(yī)學  此模型是Vogel等根據(jù)前人經(jīng)驗，研究設(shè)計出的一種簡單飲水模型，為非條件沖突實驗，并成功地用于抗焦慮藥物的篩選。其建立依據(jù)為：禁水大鼠的飲水動機與它同時所遭受的足電擊懲罰形成矛盾沖突狀態(tài)。抗焦慮藥物增加懲罰期大鼠的舔水次數(shù)，致焦慮劑則使之降低。但是，影響藥物自發(fā)飲水的藥物可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此有測定大鼠自發(fā)飲水量的變化。方法是：在第二階段的懲罰期不加電擊，記錄3min的舔水次數(shù)。在評價抗焦慮藥物時，電流強度應(yīng)偏小(以0.25～0.35mA為宜)；評價致焦慮藥物時，電流強度可偏大。